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一种新的抑制腺病毒复制方法:CRISPR-Cas9靶向病毒E1a基因

编译者:hujm发布时间:2023-6-7点击量:48 来源栏目:科技动态

识别DNA的CRISPR-CAS系统迅速发展成为编辑细胞DNA的工具。在工程版本中,单个引导RNA(GRNA)引导Cas9到与所谓的“Protspacer邻近基序”(PAM;50-NGG-30)相邻的目标序列,随后切割dsDNA并通过非同源末端连接修复断裂(NHEJ)。

结果,裂解部位发生了小的插入或缺失(Indels),这可能导致框架移位,从而使受影响的蛋白质失去活性。此外,同源定向修复(HDR)途径被激活,并可被利用来将DNA插入到靶点。CRISPR-CAS系统还被用于灭活人类免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、乙肝病毒(乙肝)、疱疹病毒和人乳头状瘤病毒(HPV)等病毒的(PRO)病毒DNA。

然而,在大多数情况下,病毒DNA是以非复制状态存在的,要么被整合到宿主染色体中,要么以稳定的染色体外形式存在,拷贝数较低。在这些研究中,主要目标是从受感染的细胞中消除病毒基因组,因为它们抵抗传统药物的消除。

近日,来自克雷姆斯应用科学大学的研究者们在Molecular Therapy: Nucleic Acids杂志上发表了题为“Inhibition of adenovirus replication by CRISPR-Cas9-mediated targeting of the viral E1A gene”的文章,该研究揭示了CRISPR-Cas9靶向病毒E1a基因对腺病毒复制的抑制作用。

靶向DNA的CRISPR-Cas系统能够在哺乳动物细胞中切割dsDNA。因此,它们被用来靶向dsDNA病毒的基因组,主要是当存在于低拷贝数的非复制状态的细胞中时。然而,某些裂解复制病毒在很短的时间内产生的大量病毒DNA可能会使CRISPR-Cas系统的能力达到极限。

病毒DNA复制位点的可及性、包裹前DNA的可及性短时间或其与屏蔽蛋白的络合作用是进一步的潜在障碍。腺病毒是一种快速复制的dsDNA病毒,目前还没有批准的抗病毒疗法。我们用一组引导RNA靶向CRISPR-Cas9的主调控子E1a,评估了CRISPR-Cas9在体外抑制人腺病毒5复制的效力,并观察到感染性病毒颗粒减少了三个数量级。

靶DNA的切割也对感染周期中积累的病毒DNA的量产生了负面影响。这一结果主要是由于靶点之间发生的特定缺失、倒置和重复导致的,在大多数情况下取消了大多数E1a功能。此外,我们比较了两种策略的多重gRNA表达,并获得了可比较的结果。

由于与任何全身给药相关的风险,局部感染的局部治疗可能有更高的机会实现。眼睛构成了理想的基因治疗靶点。高滴度的载体可以用小体积实现,而且因为它是一个很大程度上封闭的器官,全身分布和副作用被降到最低。因此,眼部局部的腺病毒感染可以用基于CRISPR-Cas9的未来疗法进行局部治疗。

参考文献

Zrinka Didara et al. Inhibition of adenovirus replication by CRISPR-Cas9-mediated targeting of the viral E1A gene. Mol Ther Nucleic Acids. 2023 Mar 3;32:48-60. doi: 10.1016/j.omtn.2023.02.033.

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